基因诊断是指检测感染者体内病毒核酸的有无,或含量多少来进行病原学诊断的一类方法,它可用在各种感染性疾病的诊断中,尤其在病毒性肝炎的诊断得到广泛应用。病毒性肝炎基因诊断包括病毒基因种类及含量、基因分型、亚型和变异及准种等的诊断。由于甲型肝炎和戊型肝炎无慢性化,且有较好的血清学诊断指标,故一般不需进行基因诊断。至于HGV和TTV,因至今未能明确其对人类的致病性,基因诊断在临床上也较少应用,目前主要用在基础和实验研究中,为此,仅对基因诊断在慢性乙型肝炎和丙型肝炎中的应用加以切磋。
由于乙型肝炎病毒抗原,特别是表面抗原,在血液中的浓度较高,现症HBV感染通过抗原检测,特别是在使用通过批批检的试剂时,即能明确诊断。虽然有国外作者报道,血清学检测仅抗HBc单项阳性,也可在血清中检测到 HBV DNA,但此类患者毕竟少之又少。因此,乙型肝炎的诊断往往不需要进行病毒核酸的检测。但在对患者进行抗病毒治疗时,血清中的病毒核酸含量是反映病毒数量和复制活跃程度最可靠的直接指标,因此,病毒含量的检测显得必不可少,它是反映动态观察药物疗效的确切指标,特别是对于HBeAg阴性患者。另外,对于丙型肝炎病毒感染的诊断,现行的第三代血清学检测试剂虽有较好的敏感性和特异性,但约有20%患者可不出现抗体,或有的患者抗体存在时间可以很长,因此,对其进行病毒核酸的检测以明确是否存在现行感染,是非常必要的。HCV感染后,由于抗体出现的较晚,要早期诊断也只有进行核酸的检测。因此,核酸检测在HCV感染的诊断中要比HBV感染的诊断重要得多。
最初临床上应用最多的HBV DNA检测方法为斑点杂交,它有较好的稳定性和特异性,也不需要昂贵的设备,但它是一种定性检查,且敏感性较低(检测敏感度约在105copies/ml以上),在一定范围内不能反映出病毒含量的变化,随着PCR检测技术的发展日趋成熟,临床应用斑点杂交检测法越来越少。HCV在血液中的含量很低,且属RNA病毒,因此不能用斑点杂交检测。
从1989年成功应用PCR检测出HCV RNA以来,PCR定性检测技术在临床和科研领域得到广泛的应用。在HBV感染的诊断中,由于HBsAg容易检测,PCR定性检测意义有限。但在HCV的诊断中,由于目前不能检测抗原,要明确是否为现行病毒感染,很有必要进行PCR检测。PCR方法具有敏感性高,可检测出极微量的核酸,理论上能检测出一个拷贝的基因。因存在操作技术等方面的影响,其实际敏感性一般在几百个copies/ml左右。由于影响PCR测定的因素颇多,常易出现假阳性和假阴性结果，因此，必须根据临床上的其他资料，进行综合分析。
有作者在临床上采用血清系列稀释法检测最高稀释血清中的病毒核酸，它可测定单一个体抗病毒治疗前后血清中核酸的变化以监测抗病毒的药物疗效，但不能对个体之间进行比较，难于标准化，而且费时费力，因此不能广泛应用于临床。斑点杂交和PCR定性均不能反映病毒含量的动态变化，难以对抗病毒药物的疗效作出确切的判断。90年代初，由Chiron公司推出了第一代支链DNA（bDNA）检测试剂，其线性范围为105－109Eq/ml。bDNA检测的敏感性在HBV为1000copies/ml以上，而在HCV检测其最低限度为4.8×104copies/ml。虽然它能反映血液中病毒含量的变化，但试剂价格十分昂贵，在HBV DNA定量检测中，线性范围的下限较高,HCV RNA的定量检测中敏感性不够,难于在临床上广泛应用。90年代后期,Digene公司推出了第二代杂交捕获法检测HBV DNA的试剂,通过化学发光捕获法和信号放大技术检测HBV DNA含量,敏感范国在5×lO3-9copies/ml,且检测时间短,批内和批间变异小,特异性高,应当说较适用于临床的HBV DNA定量检测,但目前尚未推广应用。
现今发展成熟的实时定量PCR方法,应当说具有省时,费用相对较低,而且能反映血液中病毒核酸的确切数量等优点,目前也正在临床上广泛应用。但不同的检测系统的敏感性,即检测的最低病毒核酸量仍有差异。同样也存在因测定操作而出现的误差,有时误差还是较大的,此时往往要观察病毒核酸变化的趋势,以对临床结果做出正确判断。在临床对病毒性肝炎的治疗中，定性和定量PCR测定的应用不能混淆。定性检测主要是用于未知感染者的诊断,确定患者是否感染了肝炎病毒,结果分别报告为"阳性"或"阴性"。而定量测定主要用于己知感染者的抗病毒治疗时动态观察疗效,结果报告需以量来表示。如高出定量范围上限，则需对标本稀释后再测,低于定量范围下限时,则报告小于××copies/ml,不能以"阴性"形式报告。
对于定量检测PCR 时,监控用抗病毒药物治疗后,血清中病毒含量逐步下降，但一般不应得出阴性报告,因为在重复多点随机分布结果不会降到零,达不到阴性,而当前有不少报告却为阴性,所以建议用大量样本追踪,来研究出准确的报告方法,以作临床常规使用。
关于长期使用贺普丁治疗HBV DNA阳性的患者必须用PCR来测定是否产生YMDD变异,早期采用测序的方法,但操作复杂,成本高,还不能广泛应用。我所采用引入YIDD,和YVDD特异性酶切位点的PCR技术,可准确的检出血清中YIDD及YVDD变异,与测序结果完全相符。该方法成
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